固相萃取-高效液相色谱法测定牛奶中的三聚氰胺

1  前言

三聚氰胺是一种有机含氮杂环化合物，为重要的化工原料，有良好的绝缘性能和机械轻度，是木材、涂料、造纸、纺织、皮革电器等不可缺少的原料。由于蛋白质主要由氨基酸组成，食品中蛋白质测试方法常采用凯氏定氮法测定总氮来估算蛋白质含量。这种方法只能测定氮的总量，不能识别氮的来源和氮源的种类。三聚氰胺白色粉末，无味，掺杂后不易被发现，常被不法商人用作食品添加剂，以冒充食品中的蛋白质，每100g牛奶中添加0.1g三聚氰胺，就能提高0.4%蛋白质，因此三聚氰胺也被人称为"蛋白精"。三聚氰胺被摄入人体内遇到胃酸时会溶解，但是排到尿中会再次结合形成结晶，可能堵塞肾小管，随着结晶在体内含量的增多，如果不能排除，积累到一定的程度后形成结石，给肾功能带来极大的损害甚至肾衰竭而死亡。蛋白精给奶制品业带来了巨大的冲击。卫生部等5部门关于三聚氰胺在食品中的限量值的公告(卫生部公告2011年第10号)要求，婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值。

2  实验部分

2.1实验原理

《GBT 22388-2008原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》

2.2仪器与试剂

2.2.1试剂色谱纯：甲醇、乙腈、辛烷磺酸钠。分析纯：三氯乙酸、柠檬酸、氨化甲醇、柠檬酸。离子对试剂缓冲液：准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约980ml水溶解，调节pH至3.0后，定容至1L备用。三聚氰胺标准储备液：称取三聚氰胺标准品0.1g，置于100ml容量瓶中，用水溶解，稀释至刻度，得1000μg·ml-1标准储备液，于4℃避光保存。
2.2..2材料试验所用乳制品为超市购的生乳。
2.2.3仪器LC7000高效液相色谱仪(济南海能)；分析天平；高速冷冻离心机；超声波清洗机(昆山超声仪器公司)；SPE 400 全自动机械臂固相萃取仪（济南海能）；HN200多功能氮吹仪（济南海能）；涡旋混合器；其它为常规玻璃仪器。
2.2.4色谱条件色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相：C18柱，离子对试剂缓冲液-乙腈(90+10，体积比)，混匀；流速0.8ml/min；柱温：40℃；波长240nm；进样量10μl。

2.3实验前处理

称取新鲜牛乳5g，加入20ml0.1%三氯乙酸提取液，充分混匀，加入5ml2%乙酸铅溶液，均质(2min)或超声20min，10000rpm/min离心10min，取上清液5ml过混合型阳离子交换小柱(PCX)。待样液完全流出后分别用3ml甲醇和3ml水活化固相萃取柱，取上述提取液5ml过固相萃取柱，使提取液以不低于1ml/min的流速通过；分别用3ml水和3ml甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液并将小柱抽干。用5ml 5%氨化甲醇(v/v，5ml氨水+95ml甲醇)洗脱，收集洗脱液于试管中在50℃。

2.4实验过程

2.4.1 样品的制备称取新鲜牛乳5g，加入20ml0.1%三氯乙酸提取液，充分混匀，加入5ml2%乙酸铅溶液，均质(2min)或超声20min，10000rpm/min离心10min，取上清液5ml过混合型阳离子交换小柱(PCX)。待样液完全流出后分别用3ml甲醇和3ml水活化固相萃取柱，取上述提取液5ml过固相萃取柱，使提取液以不低于1ml/min的流速通过；分别用3ml水和3ml甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液并将小柱抽干。用5ml 5%氨化甲醇(v/v，5ml氨水+95ml甲醇)洗脱，收集洗脱液于试管中在50℃下，用氮气吹干，流动相定容至1ml，过0.2μm滤膜，上机测定。

标准曲线

2.4.2 标准曲线移取三聚氰胺标准储备液用乙腈逐级稀释得到的浓度为0.5、1.0、5.0、10、20μg/ml的标准工作液，分别进行高效液相色谱测定，绘制标准曲线。
2.4.3 样品测定将生乳样品经2.4.1处理后在色谱条件下进行分析，测定其峰面积，然后在标准曲线上测定三聚氰胺。

3  结果与讨论

3.1 色谱图

3.2标准曲线的绘制与检测限各种浓度的三聚氰胺工作液高效液相色谱分析结果见表1，以三聚氰胺浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示。得到标准曲线回归方程：y=52345.7x+5721.8，相关系数r=0.999。结果表明，三聚氰胺在0.5～20 μg/ml的浓度范围呈良好的线性关系。

3.3 样品检测结果对从市场购买的四个不同品牌的牛奶用建立好的高效液相色谱法进行检测，测得的结果如表3所示。结果表明，3个不同品牌牛奶中所含的三聚氰胺含量均符合国家限量标准。

4 结论
    本文建立了固相萃取-高效液相色谱法测定牛奶中的三聚氰胺的线性方程，相关系数为0.999。该法操作简便、灵敏度和精密度高、检测线性范围宽、回收率稳定，适用于奶站、乳品厂和实验室的快速筛选检测.